Программа и методы исследования

Исследование носило клинико-эпидемиологический характер. Комплексная оценка морфофункционального состояния ЩЖ проведена в динамике во всех группах радиационного риска в течение 20 лет. В соответствии с поставленными целью и задачами эпидемиологические параметры изучались на уровне района и области. Согласно разработанной программе исследования, работа была выполнена в четыре этапа.

На первом этапе исследования с целью определения вклада тиреоидной патологии в структуру заболеваемости детей и установления взаимосвязи с радиационным воздействием был проведен анализ структуры заболеваемости у детей различных групп радиационного риска и рассчитаны показатели заболеваемости. При выполнении данного этапа работы применена Международная статистическая классификация болезней и проблем, связанных со здоровьем, Х пересмотра.

На втором этапе анализировали данные официальной статистики: сравнивали показатели заболеваемости и распространенности болезней ЩЖ на радиоактивно загрязненных и радиоактивно чистых территориях.

На третьем этапе при выполнении собственных исследований применены методы аналитической эпидемиологии: 1) сплошные медицинские осмотры населения проводились в соответствии с трехуровневой системой диспансерного наблюдения, предложенной и осуществленной нами на территории Брянской области за период 1986–2002 гг.; 2) метод экспертных оценок; 3) когортный метод (позволил оценить частоту заболеваний ЩЖ среди детей, подвергшихся воздействию различных доз радиойода, и детей других групп радиационного риска в динамике за двадцатилетний период наблюдения); 4) метод «опыт — контроль» — сопоставление заболеваемости в группе детей, находящихся под влиянием радиационного фактора, с заболеваемостью в группе детей, свободных от его влияния; 5) метод «копия — пара»; 6) для определения вклада радиационного фактора в генез заболеваний ЩЖ рассчитывали показатели относительного и атрибутивного рисков.

Клиническое обследование включало проведение генеалогического анализа (сбор и анализ родословных семей на основании опроса родственников пробанда, изучения медицинской документации), анализа особенностей течения перинатального и постнатального периодов развития, клинического осмотра, оценку жалоб, определение выраженности клинических симптомов, полиорганности поражения.

При анализе данных радиационного анамнеза оценивали пути поступления и спектр радионуклидов, длительность радиационного воздействия, величину поглощенной дозы ¹³¹I ЩЖ (данные прямых дозиметрических измерений или расчет по эмпирическим формулам), определяли возраст ребенка на момент аварии на ЧАЭС. На основании опросов и данных медицинской документации изучали сведения о «медицинском облучении» с диагностической и/или лечебной целью. Ретроспективно оценивали мероприятия по «йодной защите» ЩЖ.

Для исследования морфофункционального состояния ЩЖ применен комплекс клинико-лабораторных и инструментальных методов.

Размеры ЩЖ оценивали визуально, пальпаторно (классификация размеров ЩЖ, ВОЗ, 2001) и по данным ультразвукового исследования (УЗИ).

При наличии образований в ЩЖ или при подозрении на образования (узлы, кисты, фокальная неоднородность эхо-структуры) проводили тонкоигольную пункционную биопсию (ТАБ) пораженного участка тиреоидной ткани под контролем УЗИ с последующим цитологическим исследованием пунктата. Цитоморфологический анализ выполнялся после окрашивания полученного материала гематоксилин-эозином путем световой микроскопии под увеличением в 160 и 140 раз.

Для исследования функционального состояния ЩЖ в сыворотке утренней пробы крови, взятой натощак, определяли базальное содержание тиреотропного гормона (ТТГ), свободную и общую фракции тироксина (Т₄) и трийодтиронина (Т₃), тироксин-связывающий глобулин и тиреоглобулин (ТГ). Оценивали реакцию ТТГ в ответ на острую стимуляцию тиролиберином (рифатироин, Московский эндокринный завод) в дозе 500 мкг в/в со сбором образцов крови на 0, 30, 60 и 120-й минутах пробы. Использовали иммуноферментный метод и анализатор фотометрический иммуноферментный с устройством для промывания планшетов производства фирмы «Хьюман ГмбХ» (Германия), модель Humarider со стандартными тест-наборами.

Для оценки аутоиммунного поражения ЩЖ оценивали состояние гуморального звена иммунитета по концентрации в сыворотке крови больных антител к тиреопероксидазе (АТ ТПО), к тиреоглобулину (АТ ТГ) методом иммуноферментного анализа, используя стандартные коммерческие наборы реактивов фирмы «НВО Иммунотех» (Россия).

Антитела к микросомальному антигену ЩЖ (тиреоидной пероксидазе) (АТ МАГ) человека определяли методом пассивной гемагглютинации стандартными тест-системами «Эритрогност — Тирео» НПК «ИМРЕКС» (Россия).

Ренальную экскрецию йода определяли по концентрации микроэлемента в утренней порции мочи церий-арсенитовым методом с предварительным влажным озолением по реакции Санделла — Колтхоффа в лаборатории клинической биохимии ФГУ «Эндокринологический научный центр Росмедтехнологий».

Использовали данные о средней плотности загрязнения почвы ¹³⁷Cs (зонирование территорий проживания проведено в соответствии с Федеральным законом Российской Федерации от 15.05.1991 «О социальной защите граждан, подвергшихся воздействию радиации вследствие катастрофы на Чернобыльской АЭС»), индивидуальные поглощенные дозы ¹³¹I ЩЖ, расчетные данные средних годовых эффективных доз, полученные сотрудниками НИИ радиационной гигиены г. Санкт-Петербурга. Дозиметрические методы исследования включали: анализ данных прямой дозиметрии ЩЖ, выполненной специалистами Санкт-Петербургского НИИ радиационной гигиены; реконструкцию поглощенной дозы внутреннего облучения, осуществленную пятью различными способами.

Четвертый этап исследования включал специальные методы исследования.

Для оценки мутационных процессов в соматических клетках использован метод анализа хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови. Для определения уровня хромосомных аберраций в соматических клетках применены методы обычного и дифференцированного окрашивания (G-бендинг) с кариотипированием (определяли количество аберраций на клетку, хромосомные и хроматидные аберрации, нестабильные и стабильные аберрации, сочетание разных типов аберраций).

Внеплановый синтез дезоксирибонуклеазы (ДНК) определяли методом сцинтиляционной радиометрии по включению ³Н-тимидина в общую массу клеток при подавлении репликативного синтеза ДНК оксимочевиной. Индукторами внепланового синтеза ДНК служили ультрафиолетовое облучение (УФО) и гамма-облучение.

Состояние перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по содержанию гидроперекисей (ГП) по методу В.Б. Гаврилова (1983), малонового диальдегида (МД) по методу I. Minoru (1978), антиокислительной активности плазмы крови (АОА) по методу Г.И.Клебанова (1985).

Комплексное исследование состояния иммунной системы у детей. Для исследования клеточного иммунитета проводили количественную оценку лимфоцитов периферической крови с фенотипическими признаками следующих субпопуляций: CD3⁺; CD4⁺; CD8⁺; CD4⁺/CD8⁺; CD16⁺; CD56⁺; CD25⁺; HLA-DR⁺; CD54⁺; CD11b⁺; CD71⁺; CD10⁺; CD23⁺; CD20⁺; CD38⁺; CD95⁺. Определение поверхностных антигенов лимфоцитов осуществляли методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антисывороток «Клоноспектр» (производства НПО «Медбиоспектр», Россия) к поверхностным антигенам. Для визуализации флюоресценции использовали ФИТЦ-меченые Fab-фрагменты IgG того же производства. Количественный анализ проб осуществляли на проточном цитофлюориметре. Использовали нормативы субпопуляций лимфоцитов крови, полученные с применением моноклональных антисывороток. Оценивали относительное и абсолютное число лейкоцитов, нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов. Исследовали следующие показатели гуморального иммунитета у детей: концентрации иммуногобулина М (IgM), иммуноглобулина А (IgA), иммуноглобулина G (IgG), иммуноглобулина Е (IgE); уровня среднедисперсных циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке периферической крови. Концентрацию иммуноглобулинов определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини. Уровень ЦИК в сыворотке крови определяли методом осаждения полиэтиленгликоля (ПЭГ) (M. Digeon et al., 1977). Для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови через 30 и 120 минут (описание Е.А. Кост, 1977) от начала инкубации крови со стандартной взвесью микроорганизмов (Staphylococcus аureus 209) определяли: фагоцитарное число, фагоцитарный индекс, индекс завершенности фагоцитоза.

Статистическая обработка данных. Для проведения статистического анализа составлена база данных в программе Microsoft Excel с пакетом стандартных офисных программ Microsoft 2000, включавшая более 200 параметров, в том числе: паспортные данные; данные анамнеза; данные радиационного анамнеза; результаты клинико-лабораторного и инструментального обследования; параметры цитогенетического и иммунологического обследования; данные репарационной способности ДНК; показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной систем (ПОЛ-АОС); показатели заболеваемости и распространенности заболеваний ЩЖ.