§ 8.5. Внутриклеточные окислительно-восстановительные процессы с участием 02 и н202

Реакции с участием Ог и Н2О2 играют в живом организме исключи­тельно важную роль. Не вдаваясь во все многообразие внутриклеточ­ных редокс-процессов¹, рассмотрим действие металлоферментов, ката­лизирующих реакции с участием О2, H2O2. Реакции с участием 0₂ катализируются оксидазами и оксигеназами.

Окшдазы катализируют редокс-процессы, в которых кислород выступает как электронный акцептор. Наиболее детально изучены ферменты, катализирующие 4-электронный перенос: лакказы, аскорба-токсидаза, цитохром с-оксидаза. Общее свойство этих ферментов — наличие пространственно разделенных центров окисления субстрата и восстановления кислорода.

Лакказа и аскорбатоксидаза — сходные ферменты, содержат в активных центрах ионы меди, которые в зависимости от ядерности и спектральных характеристик могут быть трех типов.

Механизм ферментативной реакции окисления субстрата — восста­новление 0₂ до воды при участии этих ферментов может быть пред­ставлен схемой

¹ Подробнее см.: Метелица Д.И. Моделирование окислительно-восстанови­тельных ферментов; Лукьянова Л.Д., Балмуханов B.C., Уголев А.Т. Кислород-зависимые процессы в клетке и ее функциональное состояние. 284

тип II тип HI

(бесцветный) (не детектируемый методом ЭПР)

из которой видно, что в центре связывания субстрата происходит окисление его ионами меди типа I. Затем через посредничество ионов меди типа Ц электроны поочередно передаются на биядерный центр типа III связывания Ог, восстанавливая кислород до воды.

Цитохром с-оксидаза локализована в митохондриях и играет клю­чевую роль в процессах клеточного дыхания, катализируя реакцию окисления цитохрома с:

4Н⁺ 4 Цитохром с (2+) + Ог ——> 4 Цитохром с (3+) + НгО (1)

Механизм этой реакции качественно аналогичен приведенному выше для случая лакказы и аскорбатоксидазы. Отличие заключается в том, что имеется два независимых центра акцептирования электрона

от субстрата — гемовый (гем а) и медный (Си ), а биядерный центр

1

восстановления Ог формируется не из двух ионов меди, а из тема а₃ и

иона меди Си. . °з

Другая распространенная группа оксидаз катализирует восстанов­ление Ог до НгОг. Как правило, эти оксидазы содержат в активном центре один бесцветный ион меди (тип И). Представителями этой группы ферментов являются: уриказа, катализирующая окисление мочевой кислоты; полифенолоксидаза, катализирующая окисление катехина в соответствующий о-хинон; оксидазы аминокислот, окисля­ющие аминокислоты в кето- или альдеги доки слоты с одновременным деаминированием (образование NHg); аминооксидазы, катализирующие окисление сложных аминов до соответствующего кетона или альдегида и NH3; гликольоксидаза, окисляющая гликолевую кислоту в глиокса-левую; ксантиноксидаза, катализирующая окисление ксантина в моче­вую кислоту, и некоторые другие. Механизмы встречаются разные — циклические и активационные. Например, в случае галактозооксидазы реализуется циклический механизм двухэлектронного окисдения суб­страта и Си⁺:

285

Окислительное действие уриказы и ряда других оксидаз связано с активацией непосредственно кислорода. Механизм процесса можно представить в виде

В механизме действия ксантиноксидазы эффективно реализуется одноэлектронное восстановление Ог (наряду с двухэлектронным). В этом ферменте субстрат окисляется под действием входящего в актив­ный центр Мо⁵⁺. Электрон затем через посредство кластеров Fe2S2 по электронно-транспортной цепи передается флавину (ФАД), участвую­щему в восстановлении Ог до О::

участвует и в механизме действия некоторых других оксидаз. 286

Оксигеназы катализируют включение одного или двух атомов кислорода в молекулу субстрата. В активном центре оксигеназ содер­жатся ионы меди и железа.

Монооксигеназы (гидроксилазы) включают в субстрат один атом О, а второй высвобождается в виде Н₂0. Как правило, гидроксилазы содержат в качестве кофактора ФАД. Наиболее распространены они у бактерий, например лактатмонооксигеназа катализирует реакцию

Ir-лактат + Ог ► ацетат + СОг + НгО

Этот фермент не требует наличия "внешнего" донора, донором служит сам субстрат.

Для многих других оксигеназ требуется внешний донор, в качестве которого обычно выступает НАДН или НАДФН. Например, салици-лат-1-монооксигеназа катализирует процесс окисления салицилата по реакции

салицилат + НАДН + Ог ► пирокатехин + НАД + НгО + СОг

В подобных реакциях флавин играет роль переносчика двух электро­нов от НАДН к одноэлектронному акцептору. Аналогичную функцию в некоторых Ге²⁺'³⁺-содержащих оксигеназах, например в фенилала-нинмонооксигеназе, играют птеридины:

Наибольшее значение имеют гидроксилирующие ферменты микро-сомального окисления, содержащие цитохром Р-450 монооксигеназы. У человека и млекопитающих цитохром Р-450-содержащая оксигеназа печени является ферментной системой, которая обладает способностью окислять и таким образом переводить в водорастворимое состояние и удалять из организма десятки и сотни тысяч низкомолекулярных соединений, в отношении которых эта ферментная система выполняет функцию, аналогичную функции иммунной системы в отношении высокомолекулярных соединений.

Механизм действия цитохрома Р-450 связан с образованием кисло-

287

родного комплекса ЧПЗ с сильным переносом заряда, сорровождаю-щимся эффективным разрывом Q—О-связи:

Р — порфириновый лиганд активного центра фермента.

Распределение по предельным структурам в таком комплексе зави­сит от локальных свойств среды. В условиях клетки доля состояний

PFe³⁺0, РГе⁴⁺(У, по-видимому, значительна. Взаимодействие комплек­са с субстратами как частицы PFe^3tO будет сопровождаться внедрени­ем атома О по связи С—Н. При взаимодействии комплекса РРеОг как

частицы РГе⁴⁺(У будет происходить окисление субстрата по ради­кальному механизму (подобно реакции с участием ОН-радикала).

В биологических системах элементарный акт переноса электрона в активном центре металлофермента зачастую сопряжен с системами переноса высвобождаемых окислительно-восстановительных эквивален­тов на большие расстояния. Это осуществляется как через посредство Fe-, S-кластерных электронно-транспортных цепей, так и флавиновых и никотинамидных коферментов.

В системе гидроксилирования субстратов с помощью цитохрома Р-450 реализуется такая последовательность превращений:

Интересно отметить, что окисление многих субстратов в микросо-мальной гидроксилирующей системе происходит идентично при ис­пользовании вместо 0₂ гидропероксидов. Это указывает на однотип­ность промежуточных частиц, образующихся при взаимодействии Р-450 с 0₂ и ROOH.

Этот пример лишний раз показывает, что процессы активации Ог и Н₂Ог тесно связаны друг с другом. 288

Природными катализаторами процессов с участием Н₂0₂ служат катал азы и пероксидазы, как правило, гемсодержащие ферменты. Каталаза приводит к разрушению избыточного пероксида водорода, содержащегося в клетке, до 0₂ и воды. Пероксидаза восстанавливает H₂0₂ до воды, используя высвобождающиеся окислительные эквива­ленты для осуществления метаболических процессов и самоочищения внутренней среды клетки от вредных веществ с электронно-донорной функцией.

Каталаза — наиболее активна из всех ферментов. Кроме Н2О2 суб­стратами для нее (в качестве донора Н), хотя и в 10 000 раз менее ак­тивными, являются низшие алифатические спирты (метанол и этанол). Поэтому в организме помимо функции регулятора Н₂С>2 каталаза учас­твует и в метаболизме этих спиртов, концентрация которых в крови может быть на много порядков больше, чем Н2О2. В обоих случаях (каталазы и пероксидазы) при взаимодействии Н₂0₂ с активным цен­тром фермента образуется промежуточный комплекс (соединение I), который может быть отождествлен с частицей типа МО⁺:

(2)

В случае каталазы окисляемым субстратом для этой частицы слу­жит вторая молекула Н₂0₂:

(3)

Суммарный каталитический процесс разложения Н2О2 при этом описывается реакцией

(4)

В случае пероксидазы субстратами служат доноры электрона и водорода. Окисление наиболее низкомолекулярных доноров (напри­мер, формиата, формальдегида) осуществляется двухэлектронно. Боль­шинство же более громоздких субстратов окисляется через последова­тельные одноэлектронные стадии с промежуточным образованием свободных радикалов субстрата и второго промежуточного комплекса (соединение Ц), реакционноспособного в отнощении DH₂:

(5)

(6)

Конечные продукты окисления DH₂ образуются либо в результате рекомбинации радикалов, либо в результате их последующих превра­ щений с участием ионов металлов переменной валентности, молекуляр­ ного кислорода и H₂0₂. 10-235 ²⁸⁹

Промежуточные комплексы, образующиеся при взаимодействии гемсодержащих ферментов с Н2О2 (соединения I, II), регистрируются спектрофотометрически, в том числе в живых клетках и в перфузиро-ванной (промываемой физиологическим раствором) печени. По стаци­онарной концентрации соединения I удается оценить содержание внутриклеточного Н₂Ог (в клетках млекопитающих оно порядка 10'⁷— 10'⁶ М). Очевидно, концентрация внутриклеточного Н₂0₂ зависит от вида клетки, содержания в ней клеточных ферментов и скорости мета­болических процессов. Так, бактерии содержат много каталазы, расте­ния — много пероксидазы, водоросли содержат и каталазу, и перокси-дазу. Много каталазы в крови, где она защищает эритроциты от окис­ления пероксидом водорода. С другой стороны, известны так называе­мые акаталаты — животные, в крови которых каталаза не обнаружена.

Ингибиторами каталазы и пероксидазы являются низкомолекуляр­ные лиганды — комплексообразователи Fe³⁺: CN~, F", N3 и др.

Освобождение восстановительных эквивалентов из органических субстратов во внутриклеточных процессах происходит в результате деятельности дегидрогеназ — ферментов, переносящих восстановитель­ные эквиваленты к НАД с образованием двухэлектронно-окисленного субстрата и НАДН. Многие дегидрогеназы содержат в качестве необ­ходимого компонента ион Zn(II).

Редокс-состояние внутриклеточной среды определяется соотноше­нием потоков окислительных эквивалентов в виде Н₂0₂ и восстанови­тельных в виде НАДН и ФАДН. В нормальном состоянии клетки дегидрогеназные реакции, сопровождающиеся образованием восстано­вительных эквивалентов, сбалансированы с оксидазными реакциями, в которых образуется Н₂0₂. Регулирование внутрщклеточных потоков окислительных и восстановительных эквивалентов осуществляется с помощью глутатиона (GSH) и аскорбиновой кислоты (DH₂):

В некоторых клетках регуляция редокс-состояния осуществляется и без участия аскорбиновой кислоты (например, в клетках сине-зеле­ных водорослей). 290

Очевидно, при интенсивном водообмене с внешней средой возможно влияние редокс-состояния среды на внутриклеточное соотношение окислительно-восстановительных эквивалентов, выражаемое отношени­ем НАД(Ф)/НАД(Ф) или АТФ/АДФ. Разбалансировка внутриклеточ­ных редокс-процессов может приводить и к разбалансировке других функциональных систем клетки (см. § 9.1).

Большое значение для жизнедеятельности клетки имеет так назы­ваемое пероксидное окисление липидов. Под этим термином понимает­ся окисление жирных кислот, входящих в состав мембран. Процесс пероксидного окисления липидов в норме регулируется ферментами, основным из которых является глутатион-пероксидаза. Физиологичес­кая значимость пероксидного окисления липидов связана с тем, что пероксиды липидов могут выступать в качестве регуляторов проница­емости клеточных мембран и активности монооксигеназных реакций.

Активация пероксидного окисления липидов под влиянием внеш­них воздействий может привести к разрушению или структурному искажению мембран и прекращению деятельности полиферментных систем, связанных с транспортом электронов на большие расстояния. Пероксидному окислению липидов способствуют процессы, сопровож­дающиеся образованием внутриклеточных ОН-радикалов. Помимо радиационно-химических эффектов радикалы ОН могут образовывать­ся и в результате каталитических окислительно-восстановительных процессов. В основном в клетке радикалы ОН образуются при катали­зе реакции 0₂ с Н₂0₂:

02 + Н₂0₂ ~♦ ОН + 0₂ + ОН" (7)

На интенсификации этой реакции основано действие многих сель­скохозяйственных препаратов. Например, разобщители процесса фото­синтеза могут приводить к накоплению внутриклеточного пероксида

водорода и 0₂- При наличии в клетке соответствующих катализаторов происходит инициирование радикалов, сопровождающееся реализаци­ей цепного вырожденного процесса окисления липидов и разрушением липидных мембран.

Среди ферментов, регулирующих внутриклеточное содержание 0₂, важное место занимает супероксиддисмутаза, катализирующая диспро-

порционирование 0₂. Обычно это Мп-, Cu-содержащие белки (БМ²⁺):

ЕМ²⁺ + 0₂ —> ЕМ⁺+ 0₂ (8)

ЕМ⁺ + 0₂ -^—► ЕМ²⁺+ Н₂0₂ (9)

291

Центральное место в "производстве" доноров Н в форме НАДН в клетке занимает цикл Кребса, осуществляющие заключительный этап окисления органических веществ до СОг и Н₂0 (см. § 9.1).

ЛИТЕРАТУРА

Арчаков А.И. Микросомальное окисление. — М.: Наука, 1975. — 326 с.

Лукьянов Л.Д., Балмуханова Б.С, Уголев А.Т. Кислородзависимые про­цессы в клетке и ее функциональное состояние. -~ М.: Наука, 1982. — 302 с.

Метелица ДЛЯ. Моделирование окислительно-восстановительных фермен­тов. — Минск: Наука и техника, 1984. — 293 с.

Методы и достижения бионеорганической химии/Под ред. К. Мак Олифф.

- М.: Мир, 1978. - 416 с.

Пикаев А.К., Кабакчи С.А. Реакционная способность первичных продуктов радиолиза воды. Справочник. — М.: Энергоиздат, 1982. — 2Q0 с.

Структура и связь. — М.: Мир, 1969. — 360 с.

Сычев А.Я. Окислительно-шсстановительный катализ комплексами метал­лов. — Кишинев: Штиинца, 1976. — 191 с.

Сычев AJL, Исак ВТ. Координационные соединения марганца в катализе.

— Кишинев: Штиинца, 1990. — 321 с.

Сычев АЛ., Исак В.Г. Гомогенный катализ соединениями железа. — Кишинев: Штиинца, 1988. — 216 с.